近日，我校校长白仲虎带领科研团队在国际顶级期刊《Bioresource Technology》（中科院1区、JCRQ1）发表突破性研究成果，成功开发出一套高效高通量筛选平台，实现谷氨酸棒杆菌重组蛋白分泌效率大幅提升，为生物医药与绿色生物制造领域提供关键技术支撑。

该平台的核心设计原理在于：ARTP（常压室温等离子体）诱变技术可对微生物基因组产生随机、多样化的突变，而荧光激活液滴微流控分选（FADS）技术则能将单个细胞包裹在皮升级微滴中，结合FlAsH-TC胞外荧光标记系统，实现对分泌型重组蛋白的超高通量、活细胞水平筛选。这一创新设计使得蛋白质分泌能力的定向进化在四轮迭代筛选后即可完成，突变株CT3-28在5 L发酵罐中重组蛋白Omp7产量达211.3 mg/L，较野生型提升82.6%。

在这项研究中，研究人员首先以猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Omp7为目标蛋白，建立了FlAsH-TC荧光检测系统。将TC标签融合至Omp7蛋白C端，当蛋白分泌到胞外后，加入FlAsH-EDT₂荧光探针，探针与TC标签特异性结合并发出荧光。通过比较荧光值与SDS-PAGE条带灰度值，验证了两者呈强正相关，证明该荧光系统可可靠替代传统蛋白检测方法进行高通量筛选。

进一步，研究人员优化了ARTP诱变条件，确定功率100 W、气体流量10 SLM、处理时间120 s为最佳参数，此时正突变率达49%。随后，研究团队开展了四轮“ARTP诱变+FADS筛选”的迭代流程：每轮诱变后，将细胞包裹于皮升级微滴中培养12 h，通过微流控芯片注入荧光底物，利用FADS自动收集高荧光微滴，分选出的细胞经平板复苏后，再通过48孔板复筛选出最优者进入下一轮。经过四轮筛选，获得四株高产突变株CT1-109、CT2-9、CT3-28和CT4-42，其中CT3-28荧光值最高，而第四轮荧光下降提示突变已饱和。

在表型验证方面，CT3-28突变株表现出优异的生长和分泌能力：其生长速率和最终OD₆₀₀均高于野生型，单位时间荧光值也显著更高。连续传代10次后，荧光强度保持稳定，证明遗传稳定性良好。质粒回补实验进一步证实，增强表型源于基因组突变而非质粒突变。更令人振奋的是，CT3-28的优越性能不局限于Omp7蛋白：当在CT3中表达VHH抗体、PINP肽、Rhv3水蛭素变体和ApxII毒素时，四种蛋白的分泌量分别提升136.2%、30%、41.3%和110%，证明CT3是一个通用型高效分泌底盘。

在工业放大验证中，研究人员在5 L发酵罐中进行补料分批发酵。结果显示，野生型Omp7产量为115.7 mg/L，而CT3-28产量达到211.3 mg/L，提升幅度高达82.6%，且在整个发酵过程中生长良好，产量持续上升。

为揭示高效分泌的分子机制，研究团队对CT1、CT2、CT3三株突变株进行了全基因组重测序（PacBio + Illumina），共发现91个SNP，其中55个为编码区非同义突变。突变基因主要富集在氧化还原过程、水解酶与转运蛋白、转录调控因子、DNA修复与代谢等四类功能。从中锁定CT3中四个基因：RS02495、RS02840、RS09555和RS15895。通过过表达和敲除功能验证，研究人员首次证实：过表达RS02840（编码外膜脂蛋白）或敲除RS02495（编码ABC转运蛋白通透酶）均可显著提升Omp7分泌水平，且不影响菌株生长。这两个基因成为谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效分泌的新的分子靶点。

我校校长白仲虎团队开发的“ARTP+FADS+FlAsH-TC”高通量筛选平台，通过多轮迭代诱变筛选、实现广谱高效分泌、精准揭示新基因靶点，成功获得重组蛋白分泌效率提升82.6%的突变株CT3-28，堪称谷氨酸棒杆菌蛋白质分泌能力改造的“加速器”。这项突破性工作为工业微生物底盘细胞的重组蛋白分泌能力优化提供了可复制、可推广的技术路径。

（内容来源：中科院苏州医工所）